Gen knockdown der Metalloproteasen Meprin alpha 1, alpha 2 und beta im Zebrabärbling Danio rerio

Die Metalloproteasen Meprin α und β übernehmen Schlüsselfunktionen in vielen (patho-) physiologischenrnProzessen. So sind sie beteiligt an der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix, an immunologischenrnReaktionen oder an entzündlichen Gewebserkrankungen. Die beiden Enzyme kommenrnhauptsächlich in den Bürstensaummembranen von Niere und Darm sowie in der Haut von Vertebratenrnvor. Für die Erforschung der biologischen Aktivität der Meprine wurde in dieser Arbeit der ModellorganismusrnDanio rerio verwendet, der vor allem durch die Möglichkeit der gentechnischen Manipulationrnprädestiniert ist. Im Fisch konnten drei homologe Enzyme (Meprin α1, α2 und β) nachgewiesenrnwerden. Während mRNA-Analysen eine nahezu ubiquitäre Verteilung der Meprine offenbarten,rnkonnte ich mittels spezifischer Antikörper die Expression auf Proteinebene nachweisen. WährendrnMeprin α1 und β verstärkt im Darmepithel und in der Epidermis lokalisiert sind, konnte Meprinrnα2 ausschließlich in der Lamina propria des Darms identifiziert werden.rnDer Hauptteil der vorliegenden Arbeit zielt auf die spezifische Reduzierung des Expressionslevels derrnMeprine in Embryonen des Zebrabärblings. Dies wurde durch die Mikroinjektion von sogenanntenrnMorpholinos in die Zygote erzielt. Morpholinos sind RNA-Moleküle, die spezifisch an die mRNA desrnZielproteins binden können und die Translation verhindern. Die auftretenden Effekte durch das Fehlenrnder Meprine lassen so Rückschlüsse auf ihre physiologische Funktion zu. Nach der Injektion vonrnMorpholinos gegen Meprin α1 zeigten sich lediglich leichte epidermale Deformationen. Bei Meprin βrnhingegen kam es zu einer massiven Fehlbildung von Organen im Rumpf- und Schwanzbereich. Diesesrnführte zu erheblichen Defekten; die Embryonen starben innerhalb der ersten 24 Stunden nach derrnBefruchtung. Demzufolge müssen Meprin α1 und Meprin β insbesondere an der Gewebsdifferenzierungrnbeteiligt sein. Dies korreliert mit verschiedenen Experimenten, u.a. an knockout Mäusen, ausrndenen hervorgeht, dass die Prozessierung und Aktivierung der Cytokine Interleukin-1β oder Interleukin-rn18 durch Meprin β erfolgen kann.rnDie Injektion von Meprin α2-Morpholinos erbrachte ein weiteres, eindrucksvolles Ergebnis: Das Blutgefäßsystemrnvon injizierten Embryonen war vollständig unterbrochen und es sammelten sich Erythrozytenrnim Bereich der Caudalvene an. Diese Phänotypen gleichen den knockdown-Experimenten mitrndem vascular endothelial growth factor VEGF-A, dem entscheidenden Wachstumsfaktor in der Angiogenesern(Blutgefäßbildung). Eine Inkubation des humanen VEGF-A mit (humanem) rekombinantemrnMeprin α bzw. β führte zu einer differenzierten Prozessierung des Moleküls. Diese Ergebnisse legenrnnahe, dass Meprin α pro-angiogenetisch wirkt, indem es VEGF-A prozessiert und damit die Gefäßbildungrnaktiviert. Aus den Daten dieser Arbeit wird die hohe Signifikanz der Meprine für die Proliferationrnund Differenzierung spezieller Gewebe deutlich, welche somit eine wichtige Grundlage für Studienrnan höheren Vertebraten darstellt.

Die Schleimkeratine TK-alpha and TK-gamma des Zebrabärblings Danio rerio

Die Schleimkeratine TKα und TKγ aus dem Schleimaal Eptatretus stoutii besitzten für Keratine außergewöhnliche Eigenschaften. In speziellen Drüsen reifen die Schleimkeratine zu 3 µm dicken und bis zu 60 cm langen kabelartigen Filamenten heran und werden anschließend zur Feindabwehr ins umgebende Wasser extrazellulär sezerniert, wodurch die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims modifiziert werden. Mittlerweile wurden die Schleimkeratine auch in höheren Wirbeltiergruppen (Knochenfische und Amphibien) entdeckt. Zu Beginn meiner Promotion war jedoch bis auf EST-Verteilungsprofile noch nichts über die Expression und Funktion der Schleimkeratine in diesen Organismen bekannt. rnIm Rahmen meiner Arbeit wurden die Schleimkeratine TKα und TKγ erstmalig im Zebrabärbling Danio rerio identifiziert und näher charakterisiert. Mittels rekombinanter Expression wurden TKα und TKγ in ausreichenden Mengen hergestellt und auf ihre Bindungseigenschaften hin untersucht. Hierbei konnte ich zeigen, dass TKα und TKγ einerseits miteinander Heteromere formen und andererseits, dass das TKα in der Lage ist, auch homopolymere Strukturen auszubilden. Letztere Eigenschaft wurde bisher noch bei keinem bekannten cytoplasmatischen Keratin beschrieben. Ergänzend zu diesen Untersuchungen wurde eine Expressionsanalyse durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Schleimkeratine im Zebrabärbling nicht extrazellulär sezerniert werden und zum anderen keine höheren, kabelartigen Strukturen ausformen. Vielmehr werden die Schleimkeratine bei adulten Tieren in den basalen Zellschichten der Epidermis exprimiert, welche keinen mechanischen Schutz in Form von Schuppen aufweisen (Stirnhautepidermis, Epidermis in Geweben zwischen den Flossenstrahlen). Innerhalb dieser Zellen formen die Schleimkeratine ein filamentöses Netzwerk aus, dass sich an der basalen Zellseite konzentriert. Eine mögliche Funktion von TKα und TKγ könnte demnach in der Erhöhung der mechanischen Integrität von stark beanspruchten Geweben liegen, die keinen Schutz in Form von Schuppen aufweisen. So werden TKα und TKγ in larvalen Entwicklungsstadien in der Epidermis, sowie im mechanisch stark beanspruchten Notochord koexprimiert. rnDa das Notochord im Zebrabärbling auch in entwicklungsbiologischen Vorgängen eine entscheidende Rolle spielt und weiterhin in aktuellen Untersuchungen am glatten Krallen-frosch Xenopus laevis Funktionen der Schleimkeratine TKα und TKγ innerhalb von Degenerationsprozessen während der Metamorphose nachgewiesen werden konnten, sind auch im Zebrabärbling Danio rerio Funktionen der Schleimkeratine TKα und TKγ im Rahmen von Entwicklungsprozessen denkbar.rn

Das Globingen-Repertoire von Amphibien und Teleostiern

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die molekulare Evolution von Globinen in Amphibien und Teleostiern untersucht und Analysen zur Genexpression ausgewählter Globine durchgeführt. Die bisher besonders für die neueren Mitglieder der Superfamilie der Globine – Neuroglobin und Cytoglobin – schwerpunktmäßig in Mammaliern erbrachten Daten sollten durch die Analyse in Amphibien und Teleostiern auf ihre generelle Gültigkeit für Vertebraten überprüft werden. Die Analysen zur Genexpression wurden sowohl in silico, basierend auf genomischen wie EST-Daten, als auch experimentell durch qualitative und quantitative RT-PCR-Nachweise durchgeführt. Die mRNA-Lokalisation wurde durch in situ-Hybridisierungen an Gewebeschnitten beziehungsweise durch Whole mount in situ-Hybridisierung an ganzen Embryonen detektiert. In einem ersten Teil der Arbeit wurde das Globin-Repertoire von Xenopus tropicalis umfassend analysiert. Die Expressionsanalyse der gefundenen Globine umfasste nicht nur adulte Tiere, sonder erstmals auch detailliert die Entwicklungsstadien eines Vertebraten. Dabei wurde festgestellt, dass die vorwiegend neuronale Expression des streng konservierten Neuroglobins ein generelles Charakteristikum aller Tetrapoden ist und bereits in der frühembryonalen Entwicklung auftritt. Auch für das als Einzelkopie im Amphibiengenom vertretene Cytoglobin konnte eine strenge Sequenzkonservierung gezeigt werden. Das Expressionsmuster des Amphibien-Cytoglobins stimmte mit dem aus Mammaliern bekannten überein und zeigte konservierte Charakteristika dieses Globins bei Tetrapoden auf. Die Analyse des Xenopus-Genoms ergab zudem, dass Krallenfrösche nicht über Myoglobin verfügen. Genomische Vergleiche syntäner Genregionen ließen auf Rearrangements in diesem Genombereich im Verlauf der Evolution schließen, in deren Folge das Myoglobingen in den Krallenfröschen deletiert wurde. Die Hämoglobine wurden in Xenopus tropicalis erstmals in einem Amphibium umfassend analysiert. Die Gene zeigten demnach eine geclusterte Anordnung: der tropische Krallenfrosch verfügte über je ein funktionelles α- bzw. β-adultes und sieben bzw. vier α- bzw. β-larvale Hämoglobine, die während der Entwicklung bzw. in adulten Tieren charakteristisch exprimiert wurden. Die Analyse der Hämoglobine hinsichtlich ihrer Lage in einem Cluster, ihrer phylogenetischen Relation zueinander und nicht zuletzt ihres Expressionsmusters ließen Rückschlüsse auf ihre Evolution zu. Zusätzlich zu diesen bereits bekannten Globinen konnte im Rahmen dieser Dissertation das Globingen-Repertoirs von Xenopus um zwei weitere, bisher unbekannte Globine erweitert werden. Diese wurden entsprechend ihrer bisher unbekannten Funktion als GlobinX und GlobinY bezeichnet. Während GlobinY bisher ausschließlich in Amphibien nachgewiesen werden konnte, wurde GlobinX zudem in Teleostiern detektiert und repräsentiert damit ein auf Anamnia beschränktes Globin. Die rekombinante Proteinexpression von Neuroglobin, Cytoglobin, GlobinX und GlobinY des tropischen Krallenfrosches zeigte ein hexakoordiniertes Bindungsschema dieser Globine in ihrem Deoxy-Zustand. In einem zweiten Teil dieser Dissertation wurden Neuroglobin und Cytoglobin in Teleostiern untersucht und die Analyse für diese zwei Gene somit über die Tetrapoden hinaus auf den gesamten Stammbaum der Vertebraten ausgedehnt. Dabei wurde deutlich, dass die vorwiegend neuronale Expression des seit 420 Millionen Jahren streng konservierten Neuroglobins ein generelles Merkmal dieses Globins in allen Vertebraten ist. Der in Amphibien und Teleostiern erbrachte und mit Ergebnissen in Mammaliern übereinstimmende Nachweis von Neuroglobin in neuronalen Geweben mit einem hohen Stoffwechsel lässt derzeit eine Funktion dieses Globins im Sauerstoffmetabolimus als wahrscheinlich erscheinen. Ob Neuroglobin dabei als kurzzeitiger Sauerstoffspeicher, O2-Transoprter oder aber in der Detoxifikation reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffspezies agiert, bleibt zu untersuchen. Für Cytoglobin konnte eine offenbar alle Teleostier betreffende Genduplikation nachgewiesen werden. Phylogenetische Analysen zeigen die Monophylie der Vertebraten-Cytoglobine. Der Vergleich der paralogen Cytoglobine der Teleostier mit dem syntänen Genombereich des humanen Cytoglobins zeigte die wahrscheinliche Entstehung der Fisch-Cytoglobine durch eine Genomduplikation in einem Vorfahren aller Teleostier vor etwa 300-450 Millionen Jahren. Die paralogen Cytoglobine zeigten in Danio rerio und Tetraodon nigroviridis differierende, charakteristische Expressionsmuster, die mit der Theorie der Subfunktionalisierung von Genen in Folge eines Duplikationsereignisses kompatibel sind. Die Analyse zeigte, dass Cygb-1 prädominant in Gehirn und Herz exprimiert wurde, Cygb-2 hingegen bevorzugt in Gehirn und Auge. Dies bestätigte indirekt die Hypothese, nach der das Cytoglobin der Mammalier zwei unterschiedliche Funktionen in differenten Geweben wahrnimmt. Die rekombinante Expression von Cygb-1 des Zebrabärblings zeigte zudem, das auch dieses Globin in seiner Deoxy-Form über ein hexakoordiniertes Bindungsschema verfügt.

Aktivität der humanen Meprin-Metalloproteasen unter Berücksichtigung potentieller Aktivatoren

Die Metalloproteasen Meprin α und Meprin β sind an essentiellen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt. Um die Funktion dieser Proteasen zu verstehen, ist es von Bedeutung, sie nicht isoliert, sondern im gesamten proteolytischen Netzwerk zu betrachten.rnDie Meprine werden in einer Vielzahl von Geweben, in Leukozyten, aber auch in Krebszellen exprimiert. In der Haut konnten die beiden Enzyme in unterschiedlichen dermalen Schichten detektiert werden, wo sie u.a. an der Kollagenassemblierung durch Abspaltung der Propeptide beteiligt sind. rnIm Zuge von Proteomics Analysen konnten mehr als 3000 proteolytische Schnittstellen von fünf Astacin-Metalloproteasen (Meprin α, Meprin β, Astacin, LAST und LAST_MAM) in Peptiden und nativen Substraten identifiziert werden und somit eine Aussage über die Spaltspezifität getroffen werden. In der vorliegenden Arbeit konnten diese Spaltspezifitäten mit Hilfe von fluorogenen Substraten in vitro verifiziert werden. Bemerkenswert hierbei ist die starke Präferenz der beiden Meprine und LAST_MAM für die Aminosäuren Aspartat und Glutamat in der P1‘ Position. rnMeprine werden als Zymogene exprimiert und müssen durch proteolytische Prozessierung einer tryptischen Protease aktiviert werden. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit waren Aktivitätsbestimmungen beider Meprine unter Berücksichtigung potentieller Aktivatoren und Substrate. Es konnten die kallikrein-related peptidases (KLK) 4, 5 und 8 als spezifische Aktivatoren identifiziert werden, wobei nur KLK5 beide Proteasen aktiviert. Sowohl KLK4 als auch KLK8 sind lediglich in der Lage, das Propeptid von Meprin β abzuspalten. Außerdem konnte biochemisch und mittels Proteomics gezeigt werden, dass proKLK7 von Meprin β prozessiert wird. Durch N-terminale Sequenzierung wurde eine Schnittstelle zwei Aminosäuren N-terminal der eigentlichen Aktivierungsstelle identifiziert. Dieser Schritt beschleunigt die Aktivierung von KLK7, wenn durch Trypsin noch das verbliebene Dipeptid abgespalten wird. rnDa einige Vertreter der humanen kallikrein-related peptidases (KLK) als Meprin-Aktivatoren identifiziert werden konnten, sollten diese im Zuge dieser Arbeit im Modellorganismus Danio rerio untersucht werden. Durch in silico und RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass keine funktionellen KLK-Homologe im Zebrafisch codiert sind. Da somit andere tryptische Proteasen an der Aktivierung der Meprine beteiligt sein müssen, wurde die Transmembran-Serinprotease TMPRSS4 analysiert. In der Tat zeigte die Reduktion des Expressionslevels von TMPRSS4 durch Morpholino-Injektion drastische Störungen in der embryonalen Entwicklung von Zebrabärblingen. Mittels Licht- und Rasterelektronenmikroskopie ließ sich eine Fehlbildung der epidermalen Haut bis zu einem Ablösen der Keratinozyten von dem darunter liegenden Gewebe feststellen. rn